反应体系与扩增程序

• 推荐体系（50μL反应）：

• Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus): 25μL（1×）123。

• 引物（10μM）：各1μL（终浓度0.2μM）123。

• 模板DNA：XμL（建议稀释5-10倍，CT值控制在20-30循环）123。

• 无菌超纯水：补至50μL123。

• 扩增程序选择：

• 两步法（高特异性）：预变性95℃ 5min → 变性95℃ 10s → 退火/延伸60℃ 30s（40循环）123。

• 三步法（高扩增效率）：增加延伸阶段（72℃ 20s）123。

应用场景与案例

典型应用：

基因表达定量分析、病毒载量检测、SNP分型等123。

CHIP-qPCR实验：用于染色质免疫沉淀后的DNA定量验证3。

实验验证：

能够有效扩增7个数量级的模板（10¹-10⁷拷贝），CT值稳定且熔解曲线单一峰。

注意事项

• 操作规范：

• 在超净台内配制反应体系，使用无核酸酶枪头和滤芯枪头123。

• 解冻后可能出现絮状沉淀，4℃混匀至澄清即可使用123。

• 结果有效性：

• CT值要求：建议CT值在15-35之间，阴性对照CT>35或无信号123。

• 熔解曲线：需为单一峰，否则可能提示非特异性扩增123。