核心成分
固定液（A液）：通常含甲醛（如4%多聚甲醛）或其他交联剂，用于稳定细胞结构，防止抗原降解或扩散。部分产品可能添加缓冲盐（如磷酸盐）以维持pH稳定性。
破膜液（B液）：含去污剂（如皂素、Triton X-100）或有机溶剂（如甲醇），通过破坏细胞膜脂质层形成孔洞，促进抗体进入胞内。部分试剂可能结合酶解法或声波辅助技术增强破膜效率。
设计优势
减少非特异性染色：优化配方可降低背景信号，提高荧光信噪比。
兼容多色染色：适用于复杂多参数流式实验，与多种荧光标记抗体兼容。
保存稳定性：未开封试剂通常可常温或低温保存数月，部分产品支持固定后样本短期储存。
固定步骤
蛋白交联：甲醛通过共价键交联细胞内蛋白质，维持抗原空间构象，防止自溶或降解。
形态稳定：固定后细胞结构完整，便于后续破膜和抗体结合。
破膜步骤
膜通透化：破膜剂破坏细胞膜脂质双层，形成纳米级孔洞，使抗体穿透至胞质或核内。
靶点暴露：胞内抗原（如细胞因子、转录因子）暴露于抗体作用范围，确保高效染色。
以下为典型操作步骤：
样本准备
制备单细胞悬液（如血液、组织消化液），离心去除上清，保留约1×10⁶个细胞。
可选步骤：使用死活染料（如Fixable Viability Dye）标记活细胞，或封闭Fc受体减少非特异性结合。
固定处理
加入等体积固定液（如A液），室温避光孵育20-60分钟。
离心后用PBS或染色缓冲液洗涤2-3次，去除残留固定剂。
破膜与染色
加入破膜液（如B液），室温孵育10-30分钟，离心洗涤。
重悬细胞于破膜液中，加入荧光标记的胞内抗体，避光孵育30-60分钟。
最后用染色缓冲液洗涤，上机检测。
操作关键点
表面标记优先：固定前需完成细胞表面抗原染色，否则可能因固定导致抗原失活或抗体脱落
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避免荧光淬灭：含醇类破膜剂（如甲醇）可能淬灭某些荧光染料（如APC、PE），需选择兼容的抗体或调整染色顺序。
样本保存：固定后样本可短期保存于固定液中，但建议尽快完成染色以避免抗原降解。
常见问题解决
荧光信号弱：检查抗体浓度、破膜时间或是否需延长抗体孵育时间。
非特异性背景高：增加洗涤次数，或使用含BSA的缓冲液减少非特异性结合。
细胞团块残留：离心后充分重悬，避免细胞聚集影响检测。
适用场景：
胞内细胞因子检测（如IFN-γ、TNF-α）。
转录因子（如Foxp3）或信号通路蛋白分析。
多色流式面板中胞内靶点的高通量筛选。
局限性：
核内抗原需使用专用核内破膜试剂（如含Triton X-100的配方）。
对某些敏感蛋白（如磷酸化位点）可能因固定导致表位遮蔽，需优化固定时间。
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