二、工作原理与应用

1. 分离机制

• 尺寸排阻层析原理：大分子（如蛋白质）因体积较大无法进入基质网状筛孔，被阻隔在基质凝胶之外，随流动溶液快速下移，先被洗脱出柱

• 小分子分离：小分子量物质（如盐离子）可进入基质网状筛孔，在凝胶内部移动，停留时间较长，后被洗脱出柱

• 图示说明：加入0.3ml样品(100pmol/μl Neurotensin in 1M NaCl)，Neurotensin在0.75-1ml处被洗脱下来，而小分子NaCl后被洗脱312

2. 广泛应用场景

• 去除培养基中的酚红，便于后续离子交换层析纯化

• 去除DNA样本中的单核苷酸，便于后续DNA测序

• 去除核酸标记反应中多余的放射性标记物

• 去除体外生物素标记反应中多余的生物素(D-Biotin)312

• 去除杂质：有效去除样品中的盐离子、去垢剂、小分子染料、缓冲剂等杂质

• 溶液置换：对蛋白质、核酸、多肽、多糖等样品进行脱盐，完成溶液置换

• 特殊应用：

三、使用方法与操作流程

1. 样品准备

• 去除不溶物：样品上样前需通过离心或0.45μm滤膜去除不溶物

• 浓度要求：在常规缓冲液中，高至70mg/ml的蛋白样品或5mg/ml的葡聚糖高分子聚合物不会影响分离效果11

2. 脱盐柱准备

• 移除堵头：先移除脱盐柱的下堵头，将脱盐柱下端浸没到超纯水中，再移除上堵头

• 注意事项：不先移除下堵头会导致上堵头因负压难以取出；不将下端浸没水中会导致负压气泡进入脱盐柱11

3. 预平衡方法（选择一种）

• 脱盐柱下端通过双母鲁尔接头(FC009)与鲁尔接口注射器(FS730)连接

• 拉动推杆使缓冲液流穿脱盐柱，重复3-4次

• 流速控制：0.5-1ml/分钟，保持基质湿润，避免空气进入11

• 向脱盐柱中加入缓冲液充满柱管，每次约2ml

• 待缓冲液全部进入脱盐柱后，再次倒入缓冲液，重复3-4次

• 优化：可使用针筒型层析柱接头(FC007)连接10ml注射器空柱管(FS810)，一次性倒入8ml缓冲液

• 重力平衡法：

• 脱盐柱下端通过双母鲁尔接头(FC009)与鲁尔接口注射器(FS730)连接

• 拉动推杆使缓冲液流穿脱盐柱，重复3-4次

• 注射器平衡法：

• 向脱盐柱中加入缓冲液充满柱管，每次约2ml

• 待缓冲液全部进入脱盐柱后，再次倒入缓冲液，重复3-4次

4. 上样与洗脱

• 上样：待缓冲液全部进入脱盐柱后，移液器吸头贴近上筛板中央缓慢加入0.3ml样品

• 补液：若上样体积不足0.3ml，需补入"(0.3-X)ml"缓冲液（X为上样体积）

• 洗脱：加入约2ml缓冲液，收集流穿液，每管收集0.25ml

• 检测：可通过A280nm紫外吸收值、蛋白浓度测定试剂盒(Bradford法)、SDS-PAGE凝胶电泳等方法检测样品1

四、注意事项与维护

1. 使用建议

• 一次性使用：为防止交叉污染，建议一次性使用

• 重复使用：如需重复使用，实验完成后先用15ml或更多H2O清洗，再用15ml 20%乙醇清洗

• 保存条件：安装并拧紧上下堵头，置于4℃或室温保存1

2. 缓冲液建议

• 常规建议：在缓冲液中加入25mM NaCl，防止潜在的离子间相互作用

• 替代方案：如不能使用NaCl，可尝试加入100mM乙酸铵(NH₄Ac)或100mM碳酸氢铵(NH₄HCO₃)

• 注意事项：当缓冲液中盐浓度>1M时，疏水性物质在柱子内停留时间可能延长；当含>1.5M (NH₄)₂SO₄时，基质可能收缩11

3. 保存条件

• 常规保存：4℃保存，两年有效；室温保存，至少一个月有效

• 避免冷冻：请勿冷冻保存，冻结会导致脱盐柱基质碎裂

• 保持湿润：保存和纯化过程中应始终保持基质湿润，避免气泡进入脱盐柱1